1. Doutor em Medicina pela UFRGS, Professor da Faculdade de Medicina da UFRGS e chefe do Servi\u00e7o de Imunologia do Hospital de Cl\u00ednicas de Porto Alegre. P\u00f3s-gradua\u00e7\u00e3o na Universidade do Texas e de Oxford.
\n2. Mestre em Gen\u00e9tica e Biologia Molecular pela UFRGS.
\n3. Mestre em Medicina pela UFRGS e m\u00e9dica do Servi\u00e7o de Imunologia do Hospital de Cl\u00ednicas de Porto Alegre.
\n4. Bi\u00f3loga do Servi\u00e7o de Imunologia do Hospital de Cl\u00ednicas de Porto Alegre<\/p>\n
Resumo<\/h3>\n
Novos testes de DNA foram desenvolvidos ap\u00f3s a queda das torres g\u00eameas de Nova York, permitindo a identifica\u00e7\u00e3o de DNA degradado, fato que acontece ap\u00f3s o falecimento devido \u00e0 decomposi\u00e7\u00e3o dos corpos pela umidade, tempo, excesso de calor, entre outros fatores. Nesse artigo, os autores apresentam os conhecimentos atuais e as precau\u00e7\u00f5es necess\u00e1rias para per\u00edcias onde o suposto pai \u00e9 falecido, como a identifica\u00e7\u00e3o de quem deve ser intimado para o exame de DNA, de acordo com o grau de import\u00e2ncia na reconstitui\u00e7\u00e3o do falecido, levando em conta as pessoas dispon\u00edveis para an\u00e1lise pericial. A identifica\u00e7\u00e3o humana pelo estudo do DNA do cromossomo masculino Y e X \u00e9 abordada como parte dos novos testes de DNA dispon\u00edveis para a investiga\u00e7\u00e3o de paternidade, especialmente quando o suposto pai \u00e9 falecido. Um caso de perfeita identifica\u00e7\u00e3o do perfil gen\u00e9tico do r\u00e9u, ap\u00f3s 28 anos de seu falecimento \u00e9 analisado, permitindo o conhecimento de como \u00e9 poss\u00edvel obter-se resultados definitivos \u00e0 luz dos novos testes de mini-STRs do DNA.<\/p>\n
Introdu\u00e7\u00e3o<\/h3>\n
A identifica\u00e7\u00e3o de paternidade, nos casos onde o suposto pai \u00e9 falecido, pode sofrer limita\u00e7\u00f5es pela escassez de indiv\u00edduos para an\u00e1lise, tanto na parte autora, quanto na do suposto pai. As raz\u00f5es podem ser v\u00e1rias, como o falecimento de uma das partes, a falta de localiza\u00e7\u00e3o de outra, a aus\u00eancia do pa\u00eds ou por n\u00e3o desejarem realizar o exame pericial. Na maioria desses casos, acontecem questionamentos sobre \u201cquem dever\u00e1 ser intimado\u201d para a realiza\u00e7\u00e3o dos testes de reconstru\u00e7\u00e3o do DNA do suposto pai (JOBIM, 1995).<\/p>\n
O DNA humano est\u00e1 dispon\u00edvel em quantidade suficiente para an\u00e1lise em todas as c\u00e9lulas nucleadas do sangue e tecidos, em menor concentra\u00e7\u00e3o no soro ou no plasma e no l\u00edquido amni\u00f3tico placent\u00e1rio (urina da crian\u00e7a). No cabelo, ele est\u00e1 bem representado nos bulbos capilares, enquanto que nos ossos fica enclausurado nas c\u00e9lulas conhecidas como osteoclastos. Em indiv\u00edduos falecidos h\u00e1 poucas horas ou dias, podemos recolher facilmente amostras de sangue puncionando veias ou o pr\u00f3prio cora\u00e7\u00e3o, al\u00e9m de cabelos que devem conter a raiz (um n\u00famero n\u00e3o inferior a vinte fios). Com o passar do tempo, at\u00e9 quatro semanas da morte, podemos usar amostras de m\u00fasculo esquel\u00e9tico (um cent\u00edmetro quadrado). Quando o indiv\u00edduo faleceu h\u00e1 mais tempo, os cabelos j\u00e1 perderam a raiz e os tecidos remanescentes costumam ter o DNA degradado, n\u00e3o sendo adequados. Nesses casos, os ossos e os dentes s\u00e3o de grande import\u00e2ncia. Os \u00faltimos podem ser decisivos se houve morte por fogo, pois a raiz dent\u00e1ria fica protegida, at\u00e9 certo ponto, pela estrutura dent\u00e1ria. O f\u00eamur e os dentes molares e pr\u00e9-molares costumam ser as pe\u00e7as preferidas ap\u00f3s a exuma\u00e7\u00e3o de indiv\u00edduos falecidos para a finalidade de an\u00e1lise do DNA (JOBIM, 1998). \u00c9 poss\u00edvel tamb\u00e9m identificar pessoas falecidas pela an\u00e1lise de antigas escovas de dente, a partir da extra\u00e7\u00e3o do DNA de c\u00e9lulas bucais que ficam com seu esqueleto preso nas cerdas, possibilitando testes confi\u00e1veis (JOBIM, 2004).<\/p>\n
O DNA humano pode ter origem autoss\u00f4mica, ou seja, proveniente de cromossomos n\u00e3o sexuais, assim como pode existir DNA do cromossomo masculino Y ou do feminino X. A maioria dos testes atuais analisa diversos locos ou locais cromoss\u00f4micos de DNA autoss\u00f4micos, entretanto os testes de DNA do cromossomo Y e X come\u00e7am a ter sua import\u00e2ncia em determinados tipos de per\u00edcias.<\/p>\n
Os primeiros genes marcadores do DNA humano foram descritos por Jeffreys e colaboradores, sendo conhecidos como minissat\u00e9lites. Esses s\u00e3o locos ou regi\u00f5es onde acontecem repeti\u00e7\u00f5es de conjuntos de oligonucleot\u00eddios em \u201ctandem\u201d, ou seja, consecutivos ou lado a lado. Essas repeti\u00e7\u00f5es t\u00eam import\u00e2ncia m\u00e9dica somente por serem marcadores biol\u00f3gicos da esp\u00e9cie humana. Os minissat\u00e9lites n\u00e3o s\u00e3o mais utilizados atualmente devido a sua substitui\u00e7\u00e3o pelos microssat\u00e9lites ou STRs (\u201cshort tandem repeats\u201d ou repeti\u00e7\u00f5es curtas em tandem\u201d). Esses locos e seus genes s\u00e3o identificados pelo m\u00e9todo de polimerase chain reaction (PCR), (MULLIS, 1987).<\/p>\n
Analisando-se um n\u00famero suficiente de locos gen\u00e9ticos de STRs podemos concluir pela inclus\u00e3o da paternidade ou pela sua exclus\u00e3o. A \u00faltima acontece quando um marcador (alelo) do DNA do autor n\u00e3o existir no perfil do DNA paterno. No caso da exist\u00eancia dessa inconformidade podemos estar frente a uma exclus\u00e3o de paternidade ou pode ter acontecido uma muta\u00e7\u00e3o. Os laborat\u00f3rios, na maioria das vezes, concluem pela exclus\u00e3o somente ap\u00f3s a identifica\u00e7\u00e3o de mais de dois locos onde o alelo paterno do filho n\u00e3o \u00e9 compartilhado pelo suposto pai.<\/p>\n
Quando o suposto pai \u00e9 falecido, procuramos reconstituir ou identificar os alelos paternos pela an\u00e1lise de ascendentes ou descendentes do mesmo. A m\u00e3e do autor e a vi\u00fava do suposto pai s\u00e3o sempre importantes e devem ser inclu\u00eddas, sendo que a \u00faltima deve ser intimada quando os seus filhos com o falecido (supostos meio irm\u00e3os) s\u00e3o analisados. A raz\u00e3o \u00e9 que identificamos no autor (em cada loco do DNA) o alelo materno e o segundo alelo \u00e9 obrigatoriamente paterno, servindo para compara\u00e7\u00e3o com os alelos paternos identificados nos parentes do falecido. Quando analisamos os supostos av\u00f3s paternos, n\u00e3o necessitamos da vi\u00fava, pois o DNA do falecido estar\u00e1 sempre presente em um dos pais. A aus\u00eancia de um alelo em comum entre o autor e seus supostos av\u00f3s \u00e9 indicativa de exclus\u00e3o de paternidade, embora outras exclus\u00f5es devam ser identificadas para a certeza cient\u00edfica.<\/p>\n
Mesmo em casos onde as m\u00e3es n\u00e3o realizam os testes, pretendemos identificar um alelo do autor em comum com um de seus poss\u00edveis tios ou irm\u00e3os paternos. Nesses casos, a certeza diminui, pois o autor tem dois alelos por loco e estamos considerando os dois alelos ao mesmo tempo, pois n\u00e3o sabemos qual \u00e9 o alelo paterno. Nos c\u00e1lculos matem\u00e1ticos, esse fato induz a resultados com \u00edndice e probabilidade de paternidade menores. Uma das regras b\u00e1sicas para o entendimento dos casos periciais onde o suposto pai \u00e9 falecido \u00e9 que cada indiv\u00edduo apresenta no m\u00e1ximo dois alelos por loco de DNA (heterozigoto). Caso apresentar somente um \u00e9 porque herdou o mesmo alelo de seu pai e de sua m\u00e3e (homozigoto). Tendo isso em mente, entre supostos irm\u00e3os (quando n\u00e3o analisamos a respectivas m\u00e3es) s\u00f3 \u00e9 poss\u00edvel existir quatro alelos diferentes, dois de heran\u00e7a materna e dois paterna. Um quinto alelo diferente, no autor, representa a exclus\u00e3o da paternidade. Caso analisarmos a vi\u00fava e seus filhos com o falecido, poderemos identificar ou reconstruir o perfil dos dois alelos do mesmo. Nessa situa\u00e7\u00e3o, um terceiro alelo no autor exclui a paternidade.<\/p>\n
Uma das dificuldades encontradas em testes de paternidade \u00e9 a possibilidade de que um irm\u00e3o do suposto pai seja o verdadeiro pai biol\u00f3gico do autor. Nesse caso \u00e9 poss\u00edvel calcularmos matematicamente essa hip\u00f3tese. A f\u00f3rmula fornece o resultado do \u00edndice avuncular e permite o c\u00e1lculo da probabilidade cumulativa avuncular, ou seja, a probabilidade do homem testado ser tio do autor. Podemos tamb\u00e9m conhecer quantas vezes o homem testado tem de chances de ser o verdadeiro pai do que ser tio do autor.<\/p>\n
Prefer\u00eancias na An\u00e1lise do DNA com suposto pai falecido<\/h3>\n
a) O autor, sua m\u00e3e (se existente) e ambos os supostos av\u00f3s paternos.<\/p>\n
b) O autor, sua m\u00e3e, a vi\u00fava (se existente) e seus filhos com o falecido, al\u00e9m de um dos av\u00f3s paternos (se existente). Quanto maior o n\u00famero de filhos melhor a possibilidade de resultados conclusivos. Em casos onde existem muitos filhos, iniciamos com a an\u00e1lise de tr\u00eas ou quatro. Na eventualidade de somente existir um, incluir um dos av\u00f3s e supostos tios (irm\u00e3os do falecido).<\/p>\n
c) O autor, sua m\u00e3e, suposta av\u00f3 e filhos (irm\u00e3os do suposto pai – maior n\u00famero poss\u00edvel).<\/p>\n
d) O DNA do cromossomo Y dever\u00e1 ser analisado em casos onde n\u00e3o se conseguiu uma exclus\u00e3o definitiva, existindo muta\u00e7\u00f5es ou a probabilidade positiva de paternidade n\u00e3o alcan\u00e7ou pelo menos 99 %. Dessa maneira podemos identificar se o autor e o suposto pai pertencem \u00e0 mesma fam\u00edlia de homens. Al\u00e9m do autor, podemos analisar comparativamente outros indiv\u00edduos masculinos pertencentes \u00e0 mesma linhagem do falecido suposto pai. Entre eles, um filho, um irm\u00e3o, um primo (filho de um irm\u00e3o do falecido), um neto (filho de um filho do falecido) entre outros. O importante \u00e9 que a corrente de indiv\u00edduos seja sempre de homens, n\u00e3o podendo ser intercalada por uma mulher.<\/p>\n
e) A an\u00e1lise do DNA do cromossomo X poder\u00e1 ser utilizada em casos dif\u00edceis onde n\u00e3o se conseguem exclus\u00f5es e os \u00edndices e probabilidades s\u00e3o baixos (menos de 99%). Nem todos os casos podem ser avaliados pelo DNA do X. Nos casos onde existe somente a autora e uma suposta irm\u00e3, existir\u00e1 sempre um alelo em comum entre as duas se forem filhas do mesmo pai. Isso se deve ao fato que o pai biol\u00f3gico sempre passa o mesmo DNA do X para suas filhas, o que n\u00e3o acontece para os filhos homens, quando passa o pr\u00f3prio DNA do Y. \u00c9 crescente a utiliza\u00e7\u00e3o desses marcadores como veremos mais adiante.<\/p>\n
f) Outra op\u00e7\u00e3o seria a da an\u00e1lise do autor e de um suposto irm\u00e3o. Nesse caso nunca ser\u00e1 obtida a exclus\u00e3o da paternidade e a parte r\u00e9 estar\u00e1 sendo prejudicada. Isso \u00e9 devido ao fato de que existindo dois alelos por loco, o autor poder\u00e1 ter dois alelos detectados. O suposto irm\u00e3o poder\u00e1 ter um dos alelos com identidade com o autor, mas esse pode ser de origem materna e n\u00e3o de seu pai biol\u00f3gico. Al\u00e9m disso, quando n\u00e3o existirem identidades, podemos estar frente a dois alelos diferentes do suposto pai presentes um em cada filho, o que n\u00e3o exclui a paternidade, mas tamb\u00e9m n\u00e3o inclui. O mais l\u00f3gico, em nossa opini\u00e3o \u00e9 observarmos o valor dos \u00edndices e adicionarmos a an\u00e1lise do DNA do Y se forem dois supostos irm\u00e3os. Nesse caso, podemos excluir a paternidade ou afirmar que somente pertencem a mesma fam\u00edlia de homens somente.<\/p>\n
g) A exuma\u00e7\u00e3o do cad\u00e1ver do suposto pai \u00e9 necess\u00e1ria sempre que n\u00e3o existam ascendentes ou descendentes ou quando esses s\u00e3o escassos, ou os resultados obtidos com os m\u00e9todos anteriores (indiretos) n\u00e3o alcan\u00e7ou probabilidades de paternidade aceit\u00e1veis ao perito e ao juiz. Nesses casos, podemos analisar o DNA do autor e o extra\u00eddo diretamente do suposto pai. No caso de d\u00favida que o cad\u00e1ver perten\u00e7a ao suposto pai, podemos incluir um reconhecido filho biol\u00f3gico na per\u00edcia. Tamb\u00e9m devemos ter cautela, pois j\u00e1 participamos de casos onde inclu\u00edram uma filha registrada que a fam\u00edlia sabia n\u00e3o ser filha do suposto pai.<\/p>\n
h) A exuma\u00e7\u00e3o dever\u00e1 ser realizada por m\u00e9dico legista ou pelo perito. As partes devem comparecer no local da exuma\u00e7\u00e3o. Os novos m\u00e9todos que utilizam os mini-STRs devem ser utilizados. A extra\u00e7\u00e3o do DNA deve ter qualidade, pois caso contr\u00e1rio, os resultados n\u00e3o ser\u00e3o confi\u00e1veis. As imagens ou eletroesferogramas dos perfis gen\u00e9ticos dos indiv\u00edduos devem ser inclu\u00eddas no laudo, pois permitem an\u00e1lise pelo juiz e pelos assistentes t\u00e9cnicos (Fig. 2).<\/p>\n
Avalia\u00e7\u00e3o do DNA pela rea\u00e7\u00e3o em cadeia da polimerase (PCR)<\/h3>\n
A PCR \u00e9 um m\u00e9todo extremamente poderoso na avalia\u00e7\u00e3o da individualidade humana. Ela permite a amplifica\u00e7\u00e3o seletiva, in vitro, de seq\u00fc\u00eancias espec\u00edficas do DNA alvo que se deseja estudar. O princ\u00edpio da rea\u00e7\u00e3o est\u00e1 no conhecimento da seq\u00fc\u00eancia do DNA alvo e em rea\u00e7\u00e3o bioqu\u00edmica complexa. A ci\u00eancia b\u00e1sica forneceu as seq\u00fc\u00eancias das regi\u00f5es de milhares de microssat\u00e9lites de import\u00e2ncia em gen\u00e9tica forense. Os locos de microssat\u00e9lites conhecidos como STRs apresentam alelos ou fragmentos de DNA de 100 a 400 pares de bases. Esses s\u00e3o os preferidos na an\u00e1lise pericial de casos de identifica\u00e7\u00e3o humana. Os STRs permitem a amplifica\u00e7\u00e3o de milhares de c\u00f3pias de fragmentos espec\u00edficos de DNA, sendo o m\u00e9todo utilizado na maioria dos laborat\u00f3rios (GONZ\u00c1LEZ-ANDRADE, 2008).<\/p>\n
A identifica\u00e7\u00e3o dos fragmentos amplificados \u00e9 realizada ap\u00f3s eletroforese capilar, seguida pela detec\u00e7\u00e3o de sinal fluorescente. O sinal fluorescente acontece quando marcamos os primers com fluorocromos. Dessa maneira podemos usar analisadores de DNA (seq\u00fcenciadores autom\u00e1ticos) que identificam os fragmentos por interm\u00e9dio de um laser. Um computador com programa dedicado permite observarmos curvas ou picos de DNA que s\u00e3o comparados entre as partes (Fig. 1, 2 e 3).<\/p>\n
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Ap\u00f3s a amplifica\u00e7\u00e3o de DNA utilizamos uma escada al\u00e9lica (ladder) na identifica\u00e7\u00e3o de fragmentos na rea\u00e7\u00e3o de PCR. Todas as possibilidades de alelos dos locos amplificados podem ser observadas e comparadas com o produto amplificado. Dessa maneira, \u00e9 poss\u00edvel conhecer o tamanho do fragmento em pares de base (pb) e seu correspondente alelo existente no indiv\u00edduo analisado. Os casos de exuma\u00e7\u00e3o devem ser analisados com reagentes conhecidos como mini-STRs.<\/p>\n
Os STRs s\u00e3o muito utilizados na an\u00e1lise de investiga\u00e7\u00e3o de paternidade, devendo-se analisar um n\u00famero suficiente de locos, geralmente 12 ou mais locos. Os STRs e mini-STRs s\u00e3o valiosos no estudo de casos em que exista necessidade de an\u00e1lise de ossos, dentes, fios de cabelo, manchas de sangue, entre outros (MAYNTZ-PRESS, 2004).<\/p>\n
A t\u00e9cnica da PCR permite tamb\u00e9m a identifica\u00e7\u00e3o do sexo do indiv\u00edduo. O loco da amelogenina apresenta um alelo de 106 pares de bases nas mulheres (XX) e um de 106 e outro de 112 pares de bases nos homens (XY).<\/p>\n
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Figura 2. Caso simples de avalia\u00e7\u00e3o da paternidade com amostras da autora, vi\u00fava e dois supostos meio irm\u00e3os da autora. No loco D21S11, a poss\u00edvel irm\u00e3 da autora (PI1) herdou o alelo 31,2 de sua m\u00e3e (vi\u00fava), sendo que o alelo 31 \u00e9 de origem paterna e ausente no autor. Completa esse resultado a an\u00e1lise do poss\u00edvel irm\u00e3o da autora (abaixo) que herdou o alelo 29 de sua m\u00e3e (vi\u00fava), sendo que o alelo 28 \u00e9 de origem paterna e ausente no autor. Nesse caso, identificamos os dois alelos paternos do falecido (31 e 28), excluindo a paternidade nesse loco.<\/p><\/div>\n
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Figura 3. Caso de exclus\u00e3o de maternidade pela an\u00e1lise do DNA extra\u00eddo da escova de dente da falecida m\u00e3e e do DNA de seu suposto filho. Observam-se exclus\u00f5es nos locos D16S539 onde a m\u00e3e apresenta os alelos 9 e 11 e o pretenso filho, os alelos 12 e 14. No loco D2S1338 a m\u00e3e apresenta alelos 17 e 22 e o suposto filho os alelos 19 e 24.<\/p><\/div>\n
STRs do Cromossomo Y<\/h4>\n
Recentemente foram descritos STRs no cromossomo masculino Y. Algumas caracter\u00edsticas desse cromossomo fazem com que seus microssat\u00e9lites (STRs) sejam importantes na an\u00e1lise forense do DNA (PONTES, 2006). Devido \u00e0 falta de um cromossomo hom\u00f3logo, n\u00e3o existe recombina\u00e7\u00e3o durante a meiose. Sendo assim, s\u00f3 identificamos alelos de origem masculina, herdados em bloco dos antepassados masculinos. A heran\u00e7a em bloco de alelos de diferentes STRs do mesmo cromossomo \u00e9 denominada heran\u00e7a haplot\u00edpica e o conjunto dos alelos chama-se hapl\u00f3tipos (BUTLER, 2002 e 2003).<\/p>\n
Dessa maneira, \u00e9 poss\u00edvel a identifica\u00e7\u00e3o de diversos locos de STRs em um homem, sendo os mesmos alelos encontrados em seu pai, irm\u00e3os, tios, primos, av\u00f4 e demais antepassados masculinos. Estudos apontam um baixo \u00edndice de muta\u00e7\u00e3o, podendo os mesmos hapl\u00f3tipos ser encontrados em v\u00e1rias gera\u00e7\u00f5es de homens, alcan\u00e7ando talvez v\u00e1rias centenas de anos (GILL, 2001).<\/p>\n
Cada alelo ou marcador do Y de determinado local do DNA apresenta uma freq\u00fc\u00eancia na popula\u00e7\u00e3o, existindo bancos de dados especializados (www.ystr.org\/index.html). Se examinarmos sete ou mais locos do DNA do Y, poderemos conhecer matematicamente a exist\u00eancia ou n\u00e3o de uma rela\u00e7\u00e3o gen\u00e9tica entre indiv\u00edduos, no entanto nunca poderemos afirmar o grau de parentesco (KAISER, 1994).<\/p>\n
Os STRs do cromossomo Y permitem reconhecer a exclus\u00e3o de paternidade quando o poss\u00edvel pai \u00e9 falecido, analisando-se o pretenso filho e homens aparentados com o suposto pai (Fig. 4).<\/p>\n
Os principais locos de STR do Y s\u00e3o: DYS19, DYS389 I, DYS389 II, DYS390, DYS391, DYS392, DYS393, GATA H4, DYS437, DYS438 e DYS448 (MAYNTZ-PRESS, 2007).<\/p>\n
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Figura 4. Exclus\u00e3o de paternidade pelo DNA do cromossomo Y entre o autor (Jo\u00e3o Fict\u00edcio) e um neto de seu suposto pai (Jos\u00e9 Fict\u00edcio). No loco DYS437 o autor apresenta o alelo 16 e o Jos\u00e9 Fict\u00edcio o alelo 14. No loco DYS438, um apresenta o alelo 9 e o outro o alelo 12. No loco DYS448 as diferen\u00e7as s\u00e3o devidas aos alelos 19 e 18.<\/p><\/div>\n
Um estudo realizado pelo Prof. Chris Tyler-Smith, da Universidade de Oxford, permitiu a prov\u00e1vel identifica\u00e7\u00e3o do conjunto de genes do cromossomo Y de Gengis Khan. As amostras utilizadas foram da popula\u00e7\u00e3o masculina da Mong\u00f3lia, levando-se em conta que o guerreiro mongol teve mais de cem filhos, os quais, por sua vez, tiveram outros milhares de filhos, todos com o mesmo perfil gen\u00e9tico do cromossomo Y. Esse perfil \u00e9 encontrado, na atualidade, em grande n\u00famero de indiv\u00edduos mong\u00f3is do sexo masculino.<\/p>\n
Outro estudo recente de import\u00e2ncia foi a identifica\u00e7\u00e3o de Sadaam Hussein, realizada pela compara\u00e7\u00e3o do conjunto ou hapl\u00f3tipo do DNA do cromossomo Y entre ele e o DNA extra\u00eddo dos corpos de seus filhos mortos em combate (Fig. 5).<\/p>\n
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Figura 5. Sadaan e seus filhos analisados pelo DNA do Y – Buttler, J.M. (2005) em Forensic DNA Typing, 2a edi\u00e7\u00e3o.<\/p><\/div>\n
<\/p>\n
STRs do Cromossomo\u00a0X<\/h4>\n
Como foi dito anteriormente, o cromossomo X apresenta tamb\u00e9m locos de microssat\u00e9lites e que permitem conhecer a heran\u00e7a sob outra perspectiva. A m\u00e3e apresentar\u00e1 em cada loco dois alelos do DNA do X (XX), enquanto os homens sempre apresentar\u00e3o um alelo desse DNA, pois o outro pertence ao DNA do Y (XY).<\/p>\n
Como exemplo, podemos observar na tabela 1 os resultados do DNA do cromossomo X de uma per\u00edcia onde a an\u00e1lise de outros 18 locos de DNA autoss\u00f4mico chegaram a uma probabilidade de paternidade de 90%, o que n\u00e3o \u00e9 satisfat\u00f3rio, pois existe 10% de chance de n\u00e3o paternidade. Nesse caso, o suposto pai era falecido e estudamos a autora, sua m\u00e3e e duas irm\u00e3s do falecido ou supostas tias da autora. Devemos levar em conta que entre irm\u00e3s somente podemos ter tr\u00eas alelos do cromossomo X, um de origem paterna e dois de origem materna.<\/p>\n
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Tabela 1: Exclus\u00e3o de paternidade pelo DNA do X de caso onde o suposto pai \u00e9 falecido.<\/p><\/div>\n
Nesse caso foi poss\u00edvel a identifica\u00e7\u00e3o de tr\u00eas exclus\u00f5es de paternidade. No loco DXS101, a autora herdou o alelo 19 de sua m\u00e3e, sendo o alelo 24 obrigatoriamente de origem paterna e que deveria estar presente no falecido r\u00e9u, irm\u00e3o das supostas tias. As tias apresentam o alelo 26 em comum, sendo esse alelo proveniente do pai ou suposto av\u00f4 da autora (que s\u00f3 pode ter um alelo do cromossomo X). Logo, os alelos maternos presente nas tias s\u00e3o o 27 e 25. Os tr\u00eas alelos do cromossomo X poss\u00edveis de existir na fam\u00edlia s\u00e3o os 26, 27 e 25. No entanto, a autora herdou o alelo paterno 24, o que \u00e9 imposs\u00edvel de acontecer ou uma muta\u00e7\u00e3o ocorreu (Fig. 7).<\/p>\n
No loco DXS7424, a autora herdou o alelo 16 de sua m\u00e3e e o 18 de seu pai biol\u00f3gico. As supostas tias herdaram o alelo 15 do seu pai e suposto av\u00f4 da autora. Al\u00e9m disso, elas herdaram os alelos maternos 17 e 16. Os tr\u00eas alelos do cromossomo X poss\u00edveis de existir na fam\u00edlia s\u00e3o 15, 17 e 16. No entanto, a autora herdou o alelo paterno 18, o que \u00e9 imposs\u00edvel de acontecer ou outra muta\u00e7\u00e3o ocorreu. No loco HPRTB novamente aconteceu a exclus\u00e3o da paternidade pelo DNA do X. O alelo paterno da autor \u00e9 o 12 e as tias apresentam o alelo paterno 15 e dois alelos maternos 13 e 15.<\/p>\n
Mini-STRs na Identifica\u00e7ao de Material Degradado<\/h4>\n
Amostras de DNA degradadas sempre foram empecilhos na identifica\u00e7\u00e3o de corpos ap\u00f3s desastres ou longo tempo de falecimento. Os testes de identifica\u00e7\u00e3o humana obtiveram o primeiro avan\u00e7o na solu\u00e7\u00e3o desses casos quando foi desenvolvida a rea\u00e7\u00e3o em cadeia da polimerase (PCR). Esse j\u00e1 foi um avan\u00e7o consider\u00e1vel, tendo em vista que os primeiros testes de DNA n\u00e3o amplificavam o mesmo, mas somente o identificavam.<\/p>\n
No entanto, mesmo amplificando o DNA n\u00e3o se obtinham resultados adequados em amostras muito degradadas, pois nelas o DNA estava muito fragmentado devido a in\u00fameros fatores.<\/p>\n
Na amplifica\u00e7\u00e3o do DNA usamos reagentes que delimitam o local do DNA que queremos amplificar e, na maioria das vezes, os iniciadores ou \u201cprimers\u201d amplificam regi\u00f5es extensas do DNA. A novidade que permitiu os novos testes foi a redu\u00e7\u00e3o do tamanho das regi\u00f5es amplificadas, ou seja, reduzindo-se os fragmentos a serem detectados (COBLE, 2005 e 2006). Logo, com os novos reagentes podemos identificar os mesmos alelos do DNA, mas s\u00f3 que com tamanhos menores, permitindo definir alelos fragmentados ou degradados (DIXON 2006). Esses reagentes foram chamados de mini-STRs.<\/p>\n
Como exemplo, um alelo de DNA que identific\u00e1vamos pelo tamanho de 340 pares de bases, com os novos reagentes, podemos identific\u00e1-lo em 120 pares de base (DRABECK, 2004). Portanto \u00e9 f\u00e1cil o entendermos que estamos analisando o mesmo DNA, mas com o n\u00facleo de identidade menor, o que chamamos de regi\u00e3o de repeti\u00e7\u00e3o (HILL, 2008). Sendo assim, a amostra identificada \u00e9 de tamanho menor, sendo mais f\u00e1cil ser detectada e comparada com a do autor (CHUNG, 2004).<\/p>\n
Os primeiros mini-STRs foram desenvolvidos pelo Laborat\u00f3rio Bode (EUA) para a identifica\u00e7\u00e3o das v\u00edtimas do World Trade Center, tendo suas seq\u00fc\u00eancias de DNA publicadas em 2004. Os testes de mini-STRs s\u00e3o analisados em forma de \u201cmultiplex\u201d, ou seja, \u00e9 poss\u00edvel a amplifica\u00e7\u00e3o e a an\u00e1lise de diversos locos de DNA ao mesmo tempo, devido \u00e0 marca\u00e7\u00e3o dos iniciadores da rea\u00e7\u00e3o (primers) com cores fluorescentes diversas (fluorocromos). Os testes s\u00e3o semelhantes aos que usamos para identificar outros STRs (BUTLER, 2003 e 2008).<\/p>\n
Realizamos recentemente testes ap\u00f3s a exuma\u00e7\u00e3o do suposto pai, falecido h\u00e1 28 anos. Utilizamos os mini-STRs (tabela 2, figuras 6 e 8). Os testes alcan\u00e7aram um \u00edndice cumulativo de positivo de paternidade de 4874 e uma probabilidade cumulativa positiva de paternidade de 99,97%, sendo que em todos os locos analisados observamos alelos em comum entre a filha e o suposto pai (exumado).<\/p>\n
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Tabela 2. Resultados dos testes de DNA ap\u00f3s a exuma\u00e7\u00e3o do suposto pai. Em todos os locos observamos identidade entre alelos da autora e do suposto pai (Fig.8).<\/p><\/div>\n
A complexidade do estudo de ossos reside principalmente na extra\u00e7\u00e3o, purifica\u00e7\u00e3o e uso de reagentes apropriados (Fig. 6). Os resultados atuais s\u00e3o nitidamente superiores aos que se obtiveram na d\u00e9cada passada, obtendo-se um perfil gen\u00e9tico no material exumado em 90% dos casos (Fig. 8). A contamina\u00e7\u00e3o existente nos ossos que se recebe para an\u00e1lise \u00e9 danosa, tendo em vista \u00e0 presen\u00e7a de agentes que degradam o DNA, assim como inibem a rea\u00e7\u00e3o de amplifica\u00e7\u00e3o. A terra, os fungos e as bact\u00e9rias s\u00e3o os principais elementos indesej\u00e1veis e que podem acarretar diversos graus de degrada\u00e7\u00e3o.<\/p>\n
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Os testes iniciam pela cuidadosa lavagem dos ossos para remo\u00e7\u00e3o de terra e outros materiais aderidos, seguindo-se da raspagem, com lixa, da superf\u00edcie do osso at\u00e9 que fique claro ou limpo. Em seguida, usamos uma serra el\u00e9trica para separar fragmentos de cerca de 1 cm2. Esses s\u00e3o colocados em cilindros contendo fragmentos de metal e introduzidos num moinho eletromagn\u00e9tico com nitrog\u00eanio l\u00edquido. O instrumento \u00e9 ligado e o magnetismo aciona a vibra\u00e7\u00e3o do metal em alta velocidade, pulverizando os ossos. No final, teremos um p\u00f3 de osso de cor branca. Quanto mais limpo o osso, melhor ser\u00e1 a amplifica\u00e7\u00e3o do DNA extra\u00eddo de dentro dos osteoclastos. A raz\u00e3o da pulveriza\u00e7\u00e3o com nitrog\u00eanio l\u00edquido decorre da necessidade de baixas temperaturas para o DNA n\u00e3o ser destru\u00eddo pelo calor.<\/p>\n
O DNA dever\u00e1 ser purificado antes de sua amplifica\u00e7\u00e3o. Na maioria dos laborat\u00f3rios utiliza-se o m\u00e9todo de fenol\/clorof\u00f3rmio e precipita\u00e7\u00e3o do DNA da solu\u00e7\u00e3o por \u00e1lcool com posterior concentra\u00e7\u00e3o em membrana ou filtro.<\/p>\n
Considera\u00e7\u00f5es finais<\/h3>\n
A an\u00e1lise da individualidade humana iniciou com a tipagem de grupos sang\u00fc\u00edneos, tipagem HLA (ant\u00edgenos leucocit\u00e1rios humanos) e identifica\u00e7\u00e3o dos minissat\u00e9lites do DNA. Passou, ent\u00e3o para os microssat\u00e9lites ou STRs e chegou aos mini-STRs. Esses \u00faltimos s\u00e3o os ideais para a an\u00e1lise de ossos e material degradado, onde somente fragmentos pequenos de DNA s\u00e3o existentes, ao contr\u00e1rio do DNA original onde as mol\u00e9culas encontram-se \u00edntegras.<\/p>\n
As tecnologias para an\u00e1lise do DNA est\u00e3o em evolu\u00e7\u00e3o. O pr\u00f3ximo passo ser\u00e1 a an\u00e1lise de peda\u00e7os de DNA conhecidos como SNPs ou polimorfismo de nucleot\u00eddeos de base \u00fanica\u201d (single nucleotide polimorphisms). Esses est\u00e3o surgindo como marcadores de interesse para a comunidade forense devido: \u00e0 sua abund\u00e2ncia no genoma humano; ao seu baixo \u00edndice de muta\u00e7\u00e3o; por permitirem a an\u00e1lise de pequenos fragmentos de DNA e pela possibilidade de automatiza\u00e7\u00e3o das an\u00e1lises com tecnologias superiores (PHILLIPS, 2006).<\/p>\n
A vantagem da utiliza\u00e7\u00e3o dos SNPs em rela\u00e7\u00e3o aos STRs, se deve ao fato que os produtos de amplifica\u00e7\u00e3o gerados s\u00e3o muito curtos (50 pares de base ou menos), permitindo o estudo de material degradado (como no caso de cad\u00e1veres em avan\u00e7ado de decomposi\u00e7\u00e3o ou carbonizados). A tipagem de SNPs \u00e9 complexa, existindo diversos m\u00e9todos para a an\u00e1lise com fluoresc\u00eancia e luminesc\u00eancia. Um total de 50 locos de SNPs devem ser analisados para obter-se a equival\u00eancia ao estudo de 15 locos de microssat\u00e9lites ou STRs. No entanto, em casos de extrema degrada\u00e7\u00e3o poderemos aceitar um n\u00famero menor de marcadores, tendo em vista ser a \u00faltima possibilidade de an\u00e1lise gen\u00e9tica (SANCHEZ, 2006 e VALLONE, 2006).<\/p>\n
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Figura 7. Estudo do DNA do cromossomo X (loco DX101). Caso explicado na tabela 1.<\/p><\/div>\n
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